​​​​​​将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择
ROX 参比荧光，选择 None 即可。

​​​​​​​​​​​​​​推荐循环参数设置：

步骤	循环数	温度	时间	收集荧光信号
1	1 cycle	95℃	2min	否
2	45 cycles	95℃	15sec	否
		60℃	30sec	是

5.结果分析判定
结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500 仪器为例）反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可设在 3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。
​​​​​​​结果判断阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线； 阴性：样本检测结果 Ct 值>40 或无 Ct 值。
​​​​​​​质控标准阴性质控品：无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示；
阳性质控品：扩增曲线有明显指数增长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

6.检测方法的局限性

1. 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
2. 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
3. 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
4. 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
5. 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
6. 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
7. 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

注意事项

1. 所有操作严格按照说明书进行；
2. 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
3. 反应液应避光保存；
4. 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5. 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6. 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7. 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
8. 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

参考文献

[1] 康文玉, 徐自忠, 高洪等. 羊痘病毒[J]. 中国畜牧兽医, 2004, 31(12)：33-36.
[2] 陈轶霞. 羊痘诊断技术研究进展[J]. 安徽农业科学, 2008, 36(34)：15008-15009.
[3]国家质量监督检验检疫总局. SN/T 2452-2010 绵羊痘和山羊痘检疫技术规范[S].
[4]李杨, 于少雄, 颜新敏, 等. 绵羊痘病毒 TaqMan-MGB 荧光定量 PCR 快速检测方法的建立[J]. 中国预防兽医学报, 2016.