重组质粒构建全流程

实验操作

一、LB培养基配置

LB培养基用于一般细菌培养，特别用于分子生物学试验中大肠杆菌的保存和培养。其中蛋白胨、酵母膏粉提供氮源、维生素和生长因子，NaCl维持均衡的渗透压，葡萄糖提供碳源，琼脂是培养基的凝固剂。

 

【试剂】

胰蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物（Yeast Extract）、NaCl、琼脂（Agar）

 

【实验步骤】

1、LB固体培养基配方（配置100ml培养基）

胰蛋白胨（Tryptone）	1g
酵母提取物（Yeast Extract）	0.5g
NaCl	1g
琼脂粉（Agar）	1.5g
双蒸水	100ml

蛋白胨很容易吸潮，在称取时动作要迅速，另外，称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品、或在称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一种药品，瓶盖也不要盖错。

2、液体培养基除不加琼脂粉以外，其余同固体培养基一样。

3、包扎

用报纸封住瓶口，再用皮筋捆扎好，用记号笔注明培养基名称、组别、日期。

4、灭菌

将上述培养基以1.05kg/cm2/121.3℃、20min高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入4℃冰箱内暂存。灭菌后，将锥形瓶放入烘箱烘干，烘干后，4℃保存。

5、LB固体培养基倒板

①配置：如上述配方配置100ml的LB固体培养基。

②抗生素的加入（以Amp抗性为例）：将凝固的培养基放入微波炉内加热至完全融化，然后置于55℃的水浴中，待培养基温度降至55℃时（手可触摸）加入100ul Amp抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。

③倒板：一般20ml倒1个板子，培养基导入培养皿后，打开盖子，在紫外下吹15-20min。

④保存：将培养皿倒置放于4℃保存，一个月内使用。

 

二、PCR获取目的基因

【试剂】

灭菌水、高保真酶（2×）、引物（上、下）、模板DNA（质粒）

【操作步骤】

加热前应先打开PCR仪预热。

1、在0.5ml PCR管中依次加入下列试剂：

①20ul体系：

灭菌水：	7ul
高保真酶（2×）：	10
上引物：	1ul
下引物：	1ul
模板DNA：	1ul
总体积：	20.0ul

2、将上述PCR反应混合物放入PCR仪中。

3、设定程序进行扩增（以所用高保真酶说明书为准）：

94℃变性5min后，开始以下循环

94℃变性----------------------------------------30s

55℃退火（退火温度不固定，根据引物进行调整）----1min

72℃延伸-----30s（延伸时间根据目的片段的长度进行调整）

共30个循环

最后循环结束后72℃反应7min，4℃冷却。

4、PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

【注】：在PCR小管中加样时，可先将各试剂加到管壁上，最后混匀。这样既节省时间，又节省枪头。

 

三、PCR产物的回收与纯化

1、溶胶：将PCR产物稍微离心片刻，电泳检测目的条带，将切好的胶放入干净的1.5ml EP管中，加330ul溶胶液（没过胶块体积的2/3），60度水浴锅放置30min左右，至其充分溶解（注：切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防DNA损伤。）

2、柱平衡：吸附柱装到收集管中，加100ul的BL，12000rpm离心30s，倒收集管废液。

3、过柱：将步骤一中的溶胶液倒入吸附柱中，静置2min，使DNA与吸附柱充分结合，12000rpm离心30s，倒收集管废液。

4、洗杂：加450ul PW，12000rpm离心30s，倒收集管废液。

5、重复步骤④。

（步骤②~步骤⑤可以在抽滤机上操作。）

6、空离：12000rpm，2min左右（可以适当多离一会），丢掉收集管，将吸附柱放到新的1.5ml离心管中。开盖，晾干5~10min，去除残余乙醇。

7、洗脱：悬空滴加30ul TB，室温放置2min，12000rpm离心30s。（条带较淡的可以少加点TB，18-20ul）。

8、贴标：丢掉吸附柱，在管盖贴上相应标签，置于-20度冰箱保存。

 

四、载体酶切反应

【试剂】

Cut Buffer、限制酶I（EcoR I）、限制酶II（BamH I）、重组质粒（plasmind）、灭菌水

【实验步骤】

1、实验前水浴准备。

2、在0.5ml的PCR管中加入下列试剂：

体系

灭菌水：	50-V
Cut Buffer：	5ul
质粒：	1ug/C
EcoR I：	1.5ul
BamH I：	1.5ul
总体积：	50ul

【注】：黑色加粗部分的体积不随总体系体积的变化而变化，即保持恒定不变。

3、37℃反应30min。

4、琼脂糖凝胶电泳检测双酶切产物。

【注】Buffer的选择：需要参考所选择的酶，必须同时适用于两种酶。详细资料请于所用内切酶官网查询。

 

五、重组反应--片段与载体连接（以2片段重组为例）

重组体系（10ul）

2x重组酶	5ul
酶切后载体	1ul
PCR产物1	2ul
PCR产物2	2ul
总体系	10ul

50度连接30分钟（*按照重组酶说明书进行）。

 

六、重组产物的转化

1、转化

①全量10ul加入至感受态细胞中，冰上放置40min。

②42℃水浴锅内热激90s（让质粒进入感受态细胞）。

③取出冰上放置5min（让感受态细胞关闭）。

④加入200ul LB无抗液体培养基，37℃摇床培养1h。

2、涂板

将上述培养液涂布在含AMP的LB固体培养基上，过夜培养。

3、挑菌

第二天晚上五点左右挑菌，在5ml LB液体培养基（加5ul AMP）中摇床培养，38℃过夜。（5ml LB培养菌+5ul AMP+用枪头挑菌，枪头可打入培养瓶中），供第二天提取质粒。

 

七、质粒的提取（protocol）

1、大肠杆菌的培养：从平板培养基上挑选单菌落接种至5ml的含有抗生素的LB液体培养基中，37℃过夜培养。

【注：培养液不宜过量，过量时会因菌量太大而溶菌不充分，纯化时会影响质粒的纯度。】

2、5ml菌液倒入5ml离心管中，10,000xg，1min离心，弃上清。（实验室用的离心机转速达不到，故将其调到最大转速12,000rmp，离心2min）

【注：rmp（转速）与rcf=xg（相对离心力），RPM只是一个习惯用法，g才是衡量转速的通用标准；不同的转子，RPM是不能通用的，g值则是通用的，也就是说，只要你在不同的离心机上用相同的g，他们的离心效果原则上是一样。】

3、加入250ul Solution I（使用前加入RNase AI，冰箱4℃冷藏），充分悬浮细菌沉淀。

【注：注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器Vortex等剧烈振荡使菌体充分悬浮。】

4、加入250ul Solution II【裂解细胞】（提前放入37℃孵育箱内预热）轻轻地上下翻转混合5-6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。

【注：此步骤不宜超过5min。】

5、加入350ul Solution III【变性蛋白】，轻轻上下翻转混合5-6次，直至形成紧实凝集块。

6、将上面液体倒入1.5ml的EP管中，13，000xg，10min离心。

7、将上述离心得到的液体倒入柱内，10,000xg，1min离心，弃液体。

8、加入500ul bufferHB，10,000xg，1min离心，弃液体。

9、加入700ul DNA wash buffer（提前加入指定体积的100%乙醇），10,000xg，1min离心，弃液体。（重复一次）

10、空离，13，000xg，2min离心。

11、将离心柱放入1.5mlEP管内，置于孵育箱内3min烘干。

12、加入60ul ddH2O（提前在60℃水浴箱内预热），60℃摇2min。

13、13,000xg，1min离心，得液体。

14、测浓度。

15、DNA经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

【注：提好的质粒需标明时间、名称等，-20℃保存。】

 

八、琼脂糖凝胶电泳

【试剂】

琼脂糖（Agarose），1xTAE电泳缓冲液，染料（SyBR Safe DNA Gel Stain），DL2000 DNA Marker，10xLoading Buffer

【实验步骤】

1、配置50ml（大样）、25ml（小样），1.5%的琼脂糖凝胶。

称取50*1.5%=0.75g琼脂糖粉末于锥形瓶中，加入50ml 1xTAE缓冲液，染料2ul（边加染料边倒TAE缓冲液于装有琼脂糖的锥形瓶中），封口。

2、放在微波炉中加热，沸腾2次，直到看不到油滴，形成均一的溶液。（一般中低档，5min）

3、插入梳子，倒入制胶槽中。

4、放在抽屉里室温、避光静置20min。

5、按下表加样。

 ①适用于检测DNA（小孔）：

Marker（DL2000）	样品
3ul	质粒（DNA）	10xLoadingBuffer	lxTAE
	3ul	1ul	6ul

②适合回收DNA（大孔）：

Marker（DL2000）	样品
6ul	质粒（DNA）	10xLoadingBuffer
	20ul	2.2ul

6、120V，电泳25min左右。

7、检测：将凝胶板放入检测仪中检测。

新建→选染料（SyBR safe）→选颜色（SyBR Green）→勾除高亮选项→检测→文本注释（字体14，颜色白色）→保存

8、验证抽提质粒浓度及大小是否符合测序标准，送测并将样品于-20度冰箱保存。

 

【注】：

1、当加入浓度的样品量小于5ul时，10xLoadingBuffer均加2ul。

2、电泳的加样孔宽度小于6mm时，每次取5ul制品电泳便可得到清晰条带，如果加样孔增宽，需适当增加Marker制品的加样量。

3、对DNA电泳而言，琼脂糖的纯度对DNA条带的清晰度影响很大。

4、进行琼脂糖凝胶电泳时，琼脂糖的浓度与DNA片段的分离性能关系密切。琼脂糖的浓度越大，对短片段的分离性能越好，反之，琼脂糖浓度越小，越有利于长片段DNA的分离。

5、当电泳后片段需回收时，选用大孔胶，当电泳只起检测作用时，选用小孔胶。

6、实验室所用Marker条带以官网说明书为准。